STA No. 396：用于评估类似或修改的体外表皮致敏试验（EpiSensA）方法的性能标准

内容提要：

本文件由经济合作与发展组织（OECD）化学品与生物技术委员会发布，属于《测试与评估系列》第396号。该文件为评估与体外表皮致敏试验（EpiSensA）方法在结构和机制上相似或经过修改的试验方法提供了性能标准（PS）。EpiSensA是一种用于识别化学物皮肤致敏潜力的体外方法，已被纳入OECD测试指南442D（附录IC），对应皮肤致敏不良结局路径（AOP）中的关键事件2（KE2，即角质形成细胞活化）。该性能标准的制定旨在促进“同类”（me-too）方法的开发，特别是使用不同重建人表皮（RhE）模型的类似方法，以解决原始方法所用LabCyte 3D皮肤模型在日本以外地区可获得性有限的问题。

性能标准主要包括三部分内容：基本测试方法组件、最低限度参考物质清单以及规定的可靠性和准确性目标值。

一、基本测试方法组件

EpiSensA方法通过定量检测暴露于受试化学物后RhE模型中四个标志基因（ATF3、GCLM、DNAJB4和IL-8）的表达变化来评估皮肤致敏性。标准方法采用6小时暴露时间，使用RT-qPCR进行基因表达定量，并同步评估细胞毒性（细胞活力需≥80%）。判定标准为：在细胞活力≥80%的条件下，至少一个标志基因的表达倍数超过相应阈值（ATF3 >15倍，GCLM >2倍，DNAJB4 >2倍，IL-8 >4倍）。

性能标准对类似或修改方法的关键要素作出了明确规定：

1. RhE模型要求：必须使用非转化人角质形成细胞构建具有多层活细胞上皮和功能性角质层的RhE模型。角质层应具备足够屏障功能，可通过基准化学物（如十二烷基硫酸钠，SLS）的IC50或ET50进行验证。VRM使用的LabCyte EPI-MODEL24的IC50接受范围为1.4-4.0 mg/mL。模型必须无细菌、病毒、支原体或真菌污染，并经组织学检查确认具有人表皮样结构。

2. 溶剂选择与溶解度评估：测试前需评估化学物的溶解度。首选溶剂为丙酮:橄榄油=4:1（AOO），其次为蒸馏水和50%乙醇/水。化学物应在所选溶剂中以50%（w/v）浓度溶解或形成稳定分散体系（10分钟内不沉降或分层）。若无法达到50%，则通过2倍系列稀释确定最高可溶浓度（至0.0122%）。若在0.0122%仍无法溶解或稳定分散，则该化学物不适用于EpiSensA方法。

3. 浓度探索研究：通过浓度探索研究确定主研究中使用的浓度范围。起始浓度为溶解度评估中确定的最高浓度或出现细胞活力<80%的最低浓度，然后进行4倍系列稀释。细胞毒性通过乳酸脱氢酶（LDH）释放法测定。若LDH法不适用，可采用MTT法或ATP法，但需额外准备用于细胞毒性评估的组织单元。

4. 主研究（基因表达分析）：每个化学物进行一次实验以得出判定结果。每个浓度使用3个组织单元，阳性对照使用0.78%（w/v）克霉唑和0.10%（w/v）4-硝基苄基溴（4-NBB）。提取总RNA（需≥500 ng），反转录为cDNA后采用TaqMan法进行RT-qPCR。以内参基因GAPDH进行归一化，通过ΔΔCt法计算各标志基因的诱导倍数。

5. 接受标准与预测模型：

   • 接受标准：溶剂对照细胞活力≥95%；克霉唑阳性对照中ATF3 >15倍且IL-8 >4倍，细胞活力≥80%；4-NBB阳性对照中GCLM >2倍且DNAJB4 >2倍，细胞活力≥80%。

   • 阳性判定：至少一个标志基因在细胞活力≥80%的浓度下超过相应阈值。

   • 阴性判定：所有标志基因均未超过阈值，且至少有一个测试浓度的细胞活力<80%。

   • 不确定情形：若所有标志基因均未超过阈值且所有测试浓度细胞活力均≥80%，则需以更高浓度重复主研究。若所有测试浓度细胞活力均<80%，则判定为“不确定”。

二、最低限度参考物质清单

列出了20种参考物质，涵盖14种皮肤致敏物（包括弱、中、强、极强等各种效力等级）和6种非致敏物。这些物质选自VRM验证研究中使用的化学物，覆盖不同的化学类别和作用机制。其中12种（以粗斜体标示）用于实验室内部重现性评估，全部20种用于实验室间重现性和预测能力评估。

三、规定的可靠性和准确性值

要求新方法在至少三个实验室中对参考物质进行测试：

• 实验室内部重现性：对12种参考物质进行3次独立实验，预测一致性应≥80.0%（VRM实际值为88.8%）。

• 实验室间重现性：对20种参考物质，三个实验室之间预测一致性应≥80.0%（VRM实际值为94.1%）。

• 预测能力：准确度和灵敏度应≥85.0%，特异性应≥65.0%（VRM实际值为准确度85.0%、灵敏度92.9%、特异性66.7%）。此外，不得将强致敏物（UN GHS 1A类）错误预测为非致敏物，除非有充分理由说明。

该性能标准为EpiSensA方法的类似或修改版本（特别是使用不同RhE模型的方法）提供了标准化的验证框架，确保其在皮肤致敏性测试中具有足够的可靠性和相关性，从而推动体外替代方法在化学品安全评估中的国际认可与应用。

STA No. 396：Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Epidermal Sensitisation Assay (EpiSensA) Test Methods.pdf