STA No. 393：关于体外免疫毒性测试中IL-2 Luc白细胞毒性试验（IL-2 Luc LTT）方法验证的报告

内容提要：

本文件由经济合作与发展组织（OECD）化学品与生物技术委员会发布，属于《测试与评估系列》第393号。该文件是日本主导的IL-2 Luc白细胞毒性试验（IL-2 Luc LTT）方法验证的完整报告，旨在系统评估该体外方法的转移性、实验室内部和实验室间重现性以及预测能力，为该方法纳入OECD测试指南并提供监管应用奠定基础。

一、研究背景与科学原理

免疫系统失衡可导致感染、肿瘤、过敏及自身免疫病等严重健康后果。化学物（包括环境污染物、食品添加剂和药物）可干扰免疫功能，因此亟需开发体外替代方法以补充或替代动物试验。此前已验证的IL-2 Luc报告基因检测法（OECD TG 444A）可检测通过影响IL-2转录而发挥免疫抑制作用的化学物，但该方法无法识别通过抗有丝分裂机制（抑制DNA合成和细胞分裂）发挥免疫抑制作用的药物（如甲氨蝶呤、霉酚酸、硫唑嘌呤等）。为解决这一局限，研究者在原有IL-2 Luc方法的基础上进行了关键修改：将化学物暴露时间从1小时延长至24小时，并调整细胞接种密度，利用2H4报告细胞系中同时表达的IL-2启动子驱动的绿色荧光素酶（SLG）和GAPDH启动子驱动的红色荧光素酶（SLR），通过检测GAPDH活性的下降（Inh-GAPLA < 0.7）和IL-2活性的代偿性升高（%抑制率 ≤ -35，即刺激效应）来判定抗有丝分裂效应。该方法被命名为IL-2 Luc白细胞毒性试验（IL-2 Luc LTT）。

二、验证研究设计

验证研究分为三个阶段：

• Phase 0（技术转移）：三个实验室使用3种非编码化学物（博来霉素、地塞米松、6-硫代鸟嘌呤）评估方法的可转移性，结果各实验室响应模式一致，技术转移成功。

• Phase I（实验室内部和实验室间重现性）：三个实验室使用5种编码化学物（霉酚酸、吲哚美辛、环孢素A、5-氟尿嘧啶、甘露醇），每种化学物进行3次独立实验。结果显示，各实验室内部重现性均为100%（15/15），实验室间重现性为100%（5/5）。

• Phase II（实验室间重现性和预测能力）：三个实验室使用20种编码化学物（包括抗有丝分裂药物、免疫抑制剂、金属化合物等），进行1次实验。实验室间重现性为90.0%（18/20）。

综合Phase I和II的结果，实验室内部平均重现性为100%（15/15），实验室间重现性为92.0%（23/25），均满足≥80%的预先设定的接受标准。

三、预测能力评估

为评估预测能力，验证管理团队制定了基于文献的免疫毒性分类标准（参考Luster et al., 1992的9项免疫毒性终点）。将化学物分类为“免疫抑制性”或“抗有丝分裂性”，并与IL-2 Luc LTT的判定结果进行比较。

• 对抗有丝分裂效应的预测：Phase I+II综合分析显示，平均灵敏度为76.5%（13/17），平均特异性为75.0%（6/8），平均预测准确率为76.0%（19/25）。

• 对免疫抑制效应的预测：平均灵敏度为71.4%（15/21），平均特异性为100.0%（4/4），平均预测准确率为76.0%（19/25）。

为进一步表征IL-2 Luc LTT的性能，主导实验室测试了83种化合物（46种药物和37种非药物化学品）。对于抗有丝分裂效应，该方法的灵敏度为63.0%（17/27），特异性为90.2%（46/51），预测准确率为80.8%（63/78）。考虑适用域后，预测准确率提高至82.7%。

四、与IL-2 Luc方法联合应用的IATA策略

由于单一方法无法覆盖所有免疫毒性机制，验证报告重点探讨了IL-2 Luc LTT与IL-2 Luc方法联合使用作为综合测试与评估方法（IATA）组成部分的价值。联合判定规则为：两种方法中至少一种为阳性，则判定为免疫抑制性。

• 对46种药物的分析：单独使用IL-2 Luc的灵敏度为48.4%，联合后提高至90.0%（27/30），预测准确率从54.3%提高至76.1%。

• 对37种非药物化学品的分析：单独使用IL-2 Luc的灵敏度为60.9%，联合后提高至82.6%（19/23），预测准确率从62.2%提高至74.3%。

• 对83种化合物的综合分析：单独使用IL-2 Luc的灵敏度为53.7%，联合后提高至86.8%（46/53），预测准确率从57.8%提高至78.2%。考虑适用域后，联合方法的灵敏度可达88.8%，预测准确率达78.7%。

五、适用域与局限性

IL-2 Luc LTT的适用域包括：适用于可溶于水或可形成稳定分散系的化学物。以下情况超出适用域：①干扰荧光素酶或发光的化学物；②需要代谢活化才能产生活性的化学物（如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、氟达拉滨）；③PMA/离子霉素刺激绕过T细胞受体上游信号通路，因此无法检测作用于上游靶点的化学物；④Jurkat细胞系可能缺乏正常T细胞激活所需的部分关键蛋白。此外，假阴性可能的机制包括：化学物显著抑制IL-2转录而无法满足“刺激效应”标准；需要代谢活化；或体外培养系统中存在保护机制（如甲氨蝶呤）。

六、结论与监管建议

IL-2 Luc LTT方法定义清晰、方案明确、数据解读标准完善，实验室内部和实验室间重现性均令人满意。虽然该方法的预测能力尚不足以作为独立方法用于监管决策，但其作为IATA的组成部分与IL-2 Luc方法联合使用时，能够显著提高对免疫抑制性化学物（尤其是通过抗有丝分裂机制起作用的药物）的检测灵敏度。因此，验证报告建议将该方法作为OECD体外免疫毒性测试指南的候选方法，用于综合测试与评估策略中。OECD测试指南计划国家协调员工作组（WNT）已于2024年4月批准了本验证报告及其同行评审结论，并建议推进IL-2 Luc LTT作为非独立体外免疫毒性测试指南的草案制定。

STA No. 393：Report of the Validation of the IL‑2 Luc Leukocyte Toxicity Test (IL‑2 Luc LTT) Assay on In Vitro Immuno‑Toxicity Testing.pdf