日期：2026-06-08
内容提要：
本文件由经济合作与发展组织（OECD）化学品与生物技术委员会发布，属于《测试与评估系列》第392号。该文件是日本主导的IL-2 Luc白细胞毒性试验（IL-2 Luc LTT）方法验证项目的同行评审报告，旨在独立评估该体外方法的科学性、可靠性、相关性及其在监管免疫毒性评估中的适用性。
一、背景与科学需求
免疫系统失衡可导致严重健康后果：免疫抑制会增加感染和肿瘤风险，而过度免疫反应则可引发超敏反应或自身免疫病。因此，识别具有免疫毒性的化学物（包括环境污染物、食品添加剂和药物）至关重要。T细胞是适应性免疫的关键启动者，其产生的白细胞介素-2（IL-2）不仅促进T细胞增殖，还维持特定T细胞亚群以维持免疫稳态。此前已验证的IL-2 Luc报告基因检测法可识别靶向T细胞的免疫抑制化学物，但该方法无法检测通过抗有丝分裂机制抑制IL-2的化学物（如某些免疫抑制药物）。为填补这一空白，研究者开发了IL-2 Luc LTT方法，专门识别通过抗有丝分裂机制靶向T细胞的免疫抑制剂。
二、同行评审专家组构成
专家组由六位国际专家组成：主席Barbara Kaplan（密西西比州立大学，美国）、Chiyomi Kubo（中外制药，日本）、Henk van Loveren（马斯特里赫特大学，荷兰）、Takayuki Yoshimoto（东京医科大学，日本）、Haley Neff-LaFord（Seagen Inc.，美国），以及来自JaCVAM的支持专家Takao Ashikaga（日本）。
三、验证研究与同行评审结论
评审专家组依据14项评价标准对验证研究报告进行了系统评估，主要结论如下：
方法原理与科学依据：检测方法基于Jurkat T细胞来源的2H4报告细胞系（携带IL-2启动子驱动的荧光素酶基因），在PMA/离子霉素刺激下检测化学物对IL-2启动子活性的影响。与原始IL-2 Luc检测不同，IL-2 Luc LTT通过延长暴露时间（48小时 vs. 6小时）特别捕获抗有丝分裂效应。专家组认为科学原理清晰，但建议在文件中更明确地区分两种方法，并补充IL-2作为免疫抑制和抗有丝分裂标志物的生物学背景。
方法标准化：提供了详细的试验方案，包括细胞培养、化学物暴露、荧光素酶活性测定及数据解读标准。验证报告中的两处不一致（表格中试剂总量与分项之和不符、细胞离心速度范围过宽）已在最终版本中更正。
重现性：
实验室内部重现性：在I期验证中，三个实验室（A、B、C）对5种编码化学物的检测结果重现性均为100%，满足≥80%的接受标准。
实验室间重现性：结合I期和II期验证，三个实验室对25种编码化学物的结果一致率为92.0%，满足≥80%的接受标准。
预测能力：
IL-2 Luc LTT单独检测抗有丝分裂免疫抑制剂的预测能力为76%（I/II期）和80.8%（85种化合物测试集）。
当IL-2 Luc LTT与原始IL-2 Luc方法联合使用时，预测能力为76-77.2%。
由于预测能力尚未达到作为独立方法的理想水平，专家组认为该方法适合作为综合测试与评估方法（IATA）的组成部分用于免疫毒性评估，而非独立替代方法。
适用域：明确定义了三类不适用情形：①干扰荧光素酶或发光的化学物；②PMA/离子霉素刺激绕过T细胞受体上游信号通路，因此无法检测作用于这些上游靶点的化学物；③Jurkat细胞系可能缺乏正常T细胞激活所需的某些关键蛋白。
熟练度化学物：建议将博来霉素硫酸盐作为抗有丝分裂阳性对照，环孢素作为阴性对照。报告中存在一处表述不一致（地塞米松 vs. 环孢素），建议修正。
GLP合规性：验证研究在GLP原则精神下进行，尽管部分参与实验室并非日常在GLP认证下运行。
3R优势：该体外方法可减少动物使用，但成本优势需结合人力、细胞维持时间和通量进一步量化比较。
四、最终结论与监管建议
专家组一致认为：IL-2 Luc LTT方法定义清晰、方案明确、数据解读标准完善、重现性良好。虽然其预测能力尚不足以作为独立方法，但可作为IATA的组成部分用于体外免疫毒性评估。OECD测试指南计划国家协调员工作组（WNT）在其第36次会议上（2024年4月）批准了本同行评审报告的结论，并建议推进IL-2 Luc LTT作为非独立体外免疫毒性测试指南的草案制定。
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