STA No. 360：关于免疫毒性（重点关注免疫抑制）体外试验的详细综述文件

内容提要：

本文件由经济合作与发展组织（OECD）化学品与生物技术委员会发布，属于《测试与评估系列》第360号。该文件系统综述了用于评价化学物质免疫毒性（重点关注免疫抑制）的体外试验方法的科学现状，提出了分层测试策略，并讨论了现有方法的性能、参考化合物选择、验证要求以及未来发展方向，旨在推动非动物试验方法在免疫毒性监管评估中的应用。

免疫系统对于维持机体完整性至关重要，免疫细胞也是呼吸、消化、神经、内分泌等多个系统的重要组成部分。暴露于免疫毒性化学物可导致严重的不良健康后果，包括增加感染和肿瘤易感性。传统的免疫毒性评估主要依赖动物体内试验（如TDAR、NK细胞活性、CTL等），但这些方法存在资源消耗大、伦理问题及种属外推不确定性等局限。因此，开发可靠的体外替代方法成为迫切需求。

文件首先概述了免疫系统的复杂性及免疫抑制的可能靶点。免疫毒性可表现为免疫抑制、免疫刺激、过敏或自身免疫。其中免疫抑制可能是由于骨髓毒性（影响免疫细胞生成）、直接白细胞毒性（杀伤淋巴细胞或髓系细胞）或干扰特定免疫功能（如细胞因子产生、T细胞/B细胞增殖、抗体生成等）所致。

基于此，文件提出了一个分层体外测试策略：

• 第1层（骨髓毒性）：采用CFU-GM等集落形成试验评估化学物对造血祖细胞的毒性。如阳性，可直接判定为免疫毒性。

• 第2层（白细胞毒性）：评估化学物对淋巴或髓系细胞的直接细胞毒性，采用MTT、LDH释放或荧光法等测定细胞活力。

• 第3层（功能性免疫毒性）：在非细胞毒性浓度下，检测化学物对特异性免疫功能的影响，包括T细胞依赖的抗体反应、淋巴细胞增殖、混合淋巴细胞反应、NK细胞活性、细胞因子产生等。

文件重点介绍了几种较成熟的体外方法：

1. 人全血细胞因子释放试验（HWBcRA）：使用新鲜或冻存的人全血，通过LPS或SEB刺激后检测IL-1β、IL-4等细胞因子，可同时评估免疫抑制和免疫刺激，已通过验证，灵敏度67%、特异性100%。

2. 多免疫毒性试验（MITA）：日本研究团队开发的基于稳定转染细胞系的报告基因检测系统，包含三种细胞系：2H4（Jurkat来源，检测IL-2和IFNγ启动子活性）、THP-G1b（THP-1来源，检测IL-1β启动子活性）、THP-G8（THP-1来源，检测IL-8启动子活性）。该组合可检测化学物对T细胞和巨噬细胞的影响，预测能力可达75-82.5%。结合IL-8 Luc试验（OECD TG 442E）形成改良MITA后，可通过聚类分析对化学物进行分类，推断其可能的免疫毒性特征。

3. 体外抗体生成试验：基于Mishell-Dutton培养体系，可替代体内TDAR，正确预测了11种受试化合物。

4. 体外抗原呈递共培养模型：使用T细胞杂交瘤和B淋巴瘤细胞系，评价化学物对抗原摄取、加工和呈递的影响。

文件还提供了参考化合物清单（约60种阳性对照和9种阴性对照），涵盖多类环境污染物、药物和工业化学品。要求任何拟用于监管目的的体外免疫毒性试验应至少测试20种化合物，灵敏度≥75%，并需在至少3个实验室间验证重现性。

尽管目前尚无OECD认可的用于检测化学物免疫抑制作用的体外试验指南，但文件指出，通过组合多种互补的体外方法（如MITA结合骨髓毒性试验）并采用聚类分析，已有能力在不使用动物的前提下初步评估化学物的免疫毒性潜力。未来随着3D免疫组织模型、微生理系统和iPSC衍生免疫细胞技术的发展，有望建立更加完整的“人免疫系统芯片”，实现体外全谱免疫毒性评估。

STA No. 360：Detailed Review Paper on In Vitro Test Addressing Immunotoxicity With a Focus on Immunosuppression.pdf