STA No. 358：关于细菌回复基因突变试验小型化版本的详细综述文件

内容提要：

本文件由经济合作与发展组织（OECD）化学品与生物技术委员会发布，属于《测试与评估系列》第358号。该文件系统综述了细菌回复基因突变试验（即Ames试验）的多种小型化版本，并通过回顾性数据分析评估了这些小型化方法与标准方法（OECD测试指南471，TG 471）在定性结果上的可比性，旨在为这些小型化方法的未来监管应用提供科学依据和建议。

细菌回复基因突变试验是检测化学物质致突变性最广泛使用的体外试验。标准方法采用90-100 mm培养皿进行平板掺入法和/或预孵育法。然而，在药物研发早期等场景下，待测化学物往往仅少量可得，标准方法难以实施。为此，研究者开发了多种小型化版本，其主要优势在于大幅减少受试物用量、降低成本和废物量，并可提高检测通量。但由于这些小型化方法尚未被纳入OECD测试指南，其数据目前不受《数据互认》（MAD）协议的覆盖，因而难以被监管机构广泛接受。

文件根据技术特征将小型化Ames试验分为四类：

1. 使用标准菌株的小型化琼脂平板试验：包括6孔板和24孔板试验，按比例缩小标准方法的各组分体积（约1/5至1/20），使用相同菌株（如TA98、TA100、TA1535、TA1537、TA97、WP2等），通过计数回复突变菌落判定结果。

2. 使用标准菌株的微波动试验：如Ames MPF™试验，采用液体培养和384孔微板格式，通过pH指示剂颜色变化判定阳性孔的比例，可自动化操作。

3. 使用非标准菌株的小型化琼脂平板试验：如生物发光Ames试验，使用转染了lux基因的工程菌株，通过光子计数检测回复突变菌落。

4. 使用非标准菌株的微波动试验：如Ames II试验，使用六种碱基特异性鼠伤寒沙门氏菌混合而成的TAMix检测碱基置换突变，同时保留TA98检测移码突变，采用与Ames MPF™相似的液体微板格式。

回顾性数据收集与分析是文件的核心内容。通过两次数据征集，共获得来自20多个实验室的8727项评估数据，涵盖429种受试化学物（其中188种为编码的专有化合物）。主要分析了四种常用小型化方法：6孔板、24孔板、Ames MPF™和Ames II。分析采用2×2列联表，计算灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率、假阴性率以及Kappa和PABAK一致性统计量。分析层面包括：单次评估（化学物-菌株-S9组合）、5菌株综合判断和2菌株综合判断（TA98+TA100）。

主要结果显示：所有小型化方法与标准方法均表现出良好至极好的一致性（PABAK大多>0.81）。其中6孔板试验表现最佳，基于62种化学物的5菌株综合判断显示灵敏度95.4%、特异性100%，假阴性率仅4.5%。Ames MPF™和Ames II的灵敏度相对较低（约70-80%），假阴性率较高（约20-27%）。24孔板试验数据集较小，结果不确定性较高。限制性分析表明，当仅与标准方法的平板掺入法（而非预孵育法）比较时，Ames MPF™和Ames II的假阴性率进一步升高。

文件明确指出，由于回顾性分析存在若干局限性（各小型化方法基于不同的化学物集，数据集以阴性结果为主，混合结果被排除，未定量分析弱阳性响应等），目前尚不能推荐任何一种小型化方法作为TG 471标准方法的完全替代品，也不能将其明确纳入现行TG 471。但考虑到小型化方法在特定场景（如受试物量有限时）下的应用价值和回顾性分析的积极结果，建议在资源允许的情况下开展进一步工作，包括对已收集数据的定量分析（浓度-响应关系、弱致突变物检测能力等），以及必要时开展前瞻性验证研究。

STA No. 358：Detailed Review Paper on the miniaturised versions of the bacterial reverse gene mutation test.pdf